Japon

le blog de Syla.

Snuff movie

Attention, c’est gore mais pas trop.

Un film poubelle acquis ces derniers jours. Vous pouvez voir l’activité d’une dendrite au cours du temps, les épines dendritiques s’allumer et s’éteindre sous l’effet des dépolarisations synaptiques ou non. Et puis le marquage calcique augmenter, signifiant que le neurone se remplit de calcium et donc meurt…

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Une autre: activité des astrocytes près d’un vaisseau sanguin. Même marquage, mais la vitesse d’acquisition n’a rien à voir: une image par seconde, et une vague calcique dure en fait entre 10 et 20 secondes (c’était moins de 500ms pour le neurone précédent). Le marquage diminue au cours du temps, à cause du ‘bleaching’: la molécule perd progressivement son pouvoir de fluorescence quand elle est stimulée par le laser.

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19 commentaires pour “Snuff movie”

  1. Azelm dit :

    Salut,
    bien sympa les vidz, même si elles sont un peu inaccessible au néophyte (dans le sens où, on ne sait pas exactement ce que se passe et de quelle manière).
    Par contre, question con, vous utilisez une "simple" microscopie à fluorescence ? Ou vous avez développé un appareil ?
    Et, est-ce une illusion ou les dendrites ont tendance à se réduire dans le temps ?

  2. ZotZ dit :

    Salut,

    Donc pour la première vidéo, tu utilises une sonde potentiometrique ? Laquelle ? Quelle résolution temporelle peux-tu avoir au mieux (je pose cette question par rapport aux potentiels d’action qui durent 10 à 20ms) ? Tu utilises le système TriMScope et/ou la génération de secondes harmoniques ? Peut-on visualiser des PA, donc avoir une bonne résolution temporelle, sur une surface assez grande (de l’ordre de plusieurs cellules 100µm par 100µm par ex) ?

    Je pose ces questions parce que je suis en plein dans mon projet de recherche pour l’allocation des bourses de mon école doctorale.

    Merci.

  3. Necro dit :

    "microscopie à fluorescence" c’est quoi? c’est un liquide qu’on injecte pour faire ressortir des parties, ou une action du microscope?

    ( Je précise; je n’y connais rien)

  4. Gaius.Baltar dit :

    Ok les gars on va vous laisser entre vous hein.

  5. Syla dit :

    Azelm - Ce sont des manips destinées à être publiées, je ne peux pas mettre les détails de protocole, ou alors je me fais assassiner par mon chef :]
    C’est de la ’simple’ fluorescence, mais visualisée par microscope biphoton. Pas d’appareil particulier développé, mais tous les appareils sont plus ou moins customisés. Et je ne crois pas que les dendrites se réduisent, que veux tu dire ?

    Necro - En gros, on remplit les astrocytes avec une sonde étant plus fluorescente en présence de calcium, donc ça permet de suivre l’évolution du calcium dans les astrocytes. Pareil pour les neurones. Quand c’est plus brillant, ça veut dire qu’il ya plus de calcium. Ensuite, la fluorescence, c’est une particularité de certaines molécules/matières: celle d’absorber une longueur d’onde et de restituer l’énergie accumulée sous une autre longueur d’onde. Si un feutre fluo ‘flashe’, c’est qu’il absorbe la lumière dans l’ultraviolet (que l’on ne voit pas) pour la restituer en jaune, bleu, etc… D’où l’impression qu’il émet plus de lumière qu’il n’en reçoit. C’est pareil pour nos astrocytes: ils sont remplis d’une sonde fluorescente, on stimule tout le tissu avec la longueur d’onde d’excitation et l’on ne regarde que la longueur d’onde d’émission. Donc on ne voit que les astrocytes fluorescents, et non tout le tissu alentour.

    ZotZ - C’est uniquement de l’imagerie calcique, aucune sonde sensible au voltage. Et le signal calcique étant beaucoup plus lent qu’un PA, on n’a pas besoin d’une telle résolution temporelle. Pour les neurones, j’ai une image toutes les 500ms. Il y a des chances pour que je manque certaines activités, oui, mais ce n’est pas très grave car c’est la même condition pour tout le monde. En diminuant la résolution et jouant sur les paramètres, on peut aller jusqu’à 75ms par frame 2D (pour du 128*128 ou 64*64) ou bien il faut passer en acquisition linéaire (sur une simple ligne de balayage, donc). On a alors une acquisition toutes les 2ms, mais évidemment on n’a plus de véritable image du neurone. Juste un time course de la ligne de scan.

    Uniquement du biphoton, pas d’imagerie par génération de seconde harmonique. En l’occurence, le setup est équipé pour, mais on est encore en train de mettre ça en place. Et c’est un sacré bordel: si vous voulez vous y mettre, je conseille d’avoir un ingénieur dédié à ça. Par cette méthode, oui, on peut visualiser les PAs, j’ai complêtement oublié la résolution spatiale (mais c’est nettement mieux que le biphoton). On espère en faire d’ici quelques mois, mais comme c’est une customisation complête du setup biphotonique, il y a des pièces qu’il faut faire à la main car personne ne vend des trucs pareils.

    Si ça t’intéresse, pour la résolution spatiale en biphotonique, j’ai une copine qui travaille sur un setup où le laser de scan est divisé en 16 et sert à ratisser sélectivement la tranche. Avec cette méthode, elle ne gagne pas franchement en résolution temporelle, mais par contre sa résolution spatiale est énorme: elle scanne 4-5000 neurones à la volée, presque toute la tranche.

  6. ZotZ dit :

    Ok, merci pour les infos.

    En fait, mon projet de recherche est purement fictif. Nous sommes notés sur ça pour le classement et donc l’attribution des bourses.

    Je te dis en deux mots ce que je voudrais faire : Y’a un papier récent (Káradóttir et al, Nat Neurosci. 2008 Apr) qui a montré qu’en injectant un courant dépolarisant dans des cellules gliales NG2 adultes (précurseurs d’oligodendrocytes), elles sont capables de générer des PAs, voir des trains de PAs. On ne sait pas ce qui provoques ces PAs en conditions physiologiques. J’aimerais, donc en imagerie biphoton SHG avec sonde potentiométrique, voir ces cellules NG2 sur tranches (genre 250µm d’épaisseur) faire des PAs et moduler cette activité électrique avec des drogues (glutamate, ATP…). Et donc, je pourrai dire que telle ou telle drogue induit les PAs sur ces cellules NG2.
    La suite serait de savoir à quoi servent ces PAs …

    Techniquement, j’ai besoin d’une super bonne résolution temporelle pour les PAs et une bonne résolution spatiale serait la bienvenue pour pouvoir analyser le plus de cellules possibles en même temps.
    Tu me diras que je pourrais faire ça en patch mais j’aimerais éviter car c’est invasif et c’est du cellule par cellule donc lent. Et grâce au biphoton je peux aller en profondeur, limiter le photobleaching et pas trop agresser ma tranche.

    Toute suggestion de ta part est la bienvenue. :)
    (Tu travailles pas chez Akiko Nishiyama par hasard ? Parce que c’est un boss des cellules NG2)

  7. Syla dit :

    ZotZ - Je l’ai lu, cet article. Fais gaffe: le truc c’est qu’on ne sait pas si ce sont des neurones ou des glies. Si un électrophysiologiste avait patché ces cellules, il aurait dit que ce sont des interneurones. Si c’avait été un morphologiste, il aurait déduit que ce sont des glies. De plus, je ne me souviens plus des détails exacts (je suis pas au labo, là), mais il me semble qu’il n’est pas possible de faire les deux en même temps. Genre elle patche des cellules qui seraient des neurones, mais d’après certaines particularités ce seraient les mêmes que celles qu’elle observe en tant que glie, donc pas de preuves directes. Il se peut en plus que ce soit tout simplement des cellules mal différenciées, genre neurones pas finis (il me semble que la proportion de ces cellules est super faible, non ?) Mais je le relirai demain, au cas où je me gourerais.

    Au point de vue purement technique, c’est bien d’imaginer des trucs super sexy et fancy, ça fait vendre, mais honnêtement sur un vrai projet, ce truc tu le ferais en patch. Pour la simple raison qu’il ya plein de trucs à découvrir encore sur ce sujet, et que le patch est simple par rapport à ces techniques. Surtout que ta sonde potentiométrique, tu l’insères comment dans ta cellule sans marquer toute ta tranche ? Réponse: faut la patcher :) Par contre fais gaffe: le bleaching est un terme utilisé pour la fluo, il n’y en a pas pour la SHG.

    Et non, je ne travaille pas du tout sur les NG2. Moi c’est de l’astrocyte et de la pyramide.

  8. Monsieur_plastic dit :

    "Ce sont des manips destinées à être publiées, je ne peux pas mettre les détails de protocole, ou alors je me fais assassiner par mon chef :]"

    C’est pas ce qu’il voulait, osef des détails de protocoles. Simplement quand tu poste des video comme avec des commentaires du genre "Uniquement du biphoton, pas d’imagerie par génération de seconde harmonique" bah putain on se dit mais c’est quoi ce charabia, il veut se la peter le binoclare c’est ça?

    Si tu vulgariser un minimum ce serait peut être moins inaccessible au néophyte, parce que pour l’instant on comprend rien et donc les video n’ont aucun interêt pour moi perso.

  9. ZotZ dit :

    Effectivement, assez peu de cellules ont été enregistrées mais leur caractérisation paraissait assez claire : marquage NG2 positif et morphologie typique de ce type cellulaire. A voir …

    Sinon, pour marquer ces cellules, je pensais utiliser des souris NG2-GFP (qui existent) pour voir facilement mes cellules et mettre la sonde dans le milieu extracellulaire. Normalement, le signal SHG ne doit me montrer que les membranes cellulaire.

    Merci de ton intérêt pour mon projet.

  10. Syla dit :

    Monsieur_plastic - Pas la peine de s’énerver. Vulgariser, je l’ai fait: c’est de l’observation de fluorescence (voir aussi mes précédents posts sur le boulot, j’ai déjà dit tout ça). Ensuite, je ne peux pas tout expliquer, ce n’est tout simplement pas possible. Et pour reprendre ta phrase en gras, je m’adressai à ZotZ, qui me semblait connaitre le sujet et donc oui, je n’ai rien vulgarisé. Sinon, rien qu’en tapant ‘ imagerie par generation de seconde harmonique’ dans Google, le premier résultat te donne la thèse d’un gars sur le sujet.

    Ou bien Wikipedia: ‘Second harmonic generation (SHG; also called frequency doubling) is a nonlinear optical process, in which photons interacting with a nonlinear material are effectively "combined" to form new photons with twice the energy, and therefore twice the frequency and half the wavelength of the initial photons.’ Et tout d’un coup tout est plus clair :)

    Les vidéos sont là parceque je les trouve jolies/intéressantes, elles permettent de rendre visuel le fonctionnement de notre cerveau. Et tout le monde comprend que ‘plus ça brille plus ça travaille’. Pour te donner un aperçu de ce que ça donne en vrai, c’est ça:

    Et ça ne me dérange pas d’expliquer certaines parties, je peux même en faire un sujet à part si ça vous intéresse vraiment, mais faut me demander lesquelles car si je me mets à tout expliquer, je ne m’en sortirai pas.

    ZotZ - Par expérience, ce que tu proposes ne marche pas. Mettre la sonde dans le milieu cellulaire, ça marche sur cultures dissociées à faible densité car on n’a qu’une épaisseur de cellules et donc pas de bruit de fond. Le mettre sur une tranche, tu marques tout et c’est un fouillis inextricable: impossible de voir à qui appartiennent telles terminaisons, etc…

  11. ZotZ dit :

    Hum …. merde, ça fait chier.
    Si jamais j’ai d’autres questions, je peux te contacter par mail via Nofrag ?

  12. Azelm dit :

    Re,

    bon déjà, j’ai trouvé les explications assez intéressantes, même si elles sont encore assez loin d’être des choses que j’utilise au jour le jour… (en réalité, je suis chimiste… pas biochimiste, et vraiment un "jeune chimiste" concernant mes idées et connaissances scientifiques).
    Après, ouais, je me doute bien que me donner le mode op’, c’est un peu abusé et sans doute inutile (toujours à mon niveau).

    Ce que je voulais dire concernant les dendrites (avec mon langage de chimiste tout newbie en bioch’ ^^), c’est que les vidéos, étant de résolution assez basses, j’ai eu l’impression de les voir régresser… rien de plus, il était fort probable que ce soit du "j’ai mal vu". D’ailleurs, rassures moi, pour pas qu’il y ait incompréhension totale, les dendrites sont bien les "branches" qui s’échappe du corps cellulaire ? Donc là, on visualise une partie d’un neurone (ou en tout cas d’une cellule nerveuse) en relativement gros plan, et le corps cellulaire traine dans le coin ?

    Une autre question qui a été évoquée, à combien est-ce qu’on estime une résolution temporelle convenable ? J’imagine que c’est lié à la cinétique même du neurone ? Ça devrait même correspondre, dans le meilleur des cas à la cinétique d’ouverture/fermeture des synapses (je ne sais pas si au niveau du dendrite on parle encore de synapse, m’enfin, j’imagine que c’est un système similaire…) puisque c’est ce phénomène qui régule le transport des ions calcium ? (je ne sais pas trop, j’essaye de comprendre plus ou moins l’idée de l’expérience)

    Après, pour encore faire un peu chier (désolé mais je suis assez intéressé…), pourquoi le neurone à t’il tendance à concentrer le Calcium ? J’imagine que ça ne se passe pas comme ça dans la réalité (j’espère pas en tout cas), c’est dû à un milieu saturé en Ca2+ ?

    Eclaire ma lanterne si tu peux/veux, sinon je me contenterai de matter tes vidz et tes photos ^^ (et d’ailleurs, si tu juges qu’il y a des papiers intéressant qui traine sur le net, te fais pas chier, balance un lien et je me démerde)
    Merci !

  13. Monsieur_plastic dit :

    Meme moi je sais que le neurone il concentre le calcium pour generer des pA via une dépolarisation de la membrane! gé bon?

  14. Azelm dit :

    Ben zut, tu sais déjà plus de truc que moi, c’est évidemment pas les premiers trucs qu’on nous apprend là où je suis. ^^
    Je viens de découvrir que PA voulait bêtement dire Potentiel d’Action… désolé, les choses simples rentrent moins bien la nuit.
    Par contre, ça n’explique pas pourquoi il meurt… ça devrait être un processus normal et parfaitement géré au sein de la cellule, non ?

  15. Syla dit :

    Azelm - Ce n’est pas du tout idiot, comme question, ça peut même être très intéressant. En l’occurence, je viens de vérifier sur le marquage physiologique (on remplit toujours le neurone avec deux sondes: une calcique, pour mesurer le calcium et une physiologique, pour voir où vont les dendrites), la dendrite ne change pas de taille (elle bouge un peu, par contre). Oui, les dendrites sont les prolongements du neurone qui vont recevoir les informations d’autres neurones.

    Pour la résolution convenable, bonne question. Ca dépend de ce que l’on veut observer. Si c’est juste l’existence de tel ou tel phénomène, disons une vague calcique d’une seconde, une résolution temporelle de 500ms suffira. On sera alors sur de ne pas en rater: on les verra toutes. Par contre, si on s’intéresse à la cinétique de ces vagues calciques (comment elles apparaissent, grandissent, disparaissent), alors il faudra diviser la résolution au moins par 10 (genre 50ms) pour avoir un profil précis de son évolution.

    Les synapses ne s’ouvrent ou se ferment pas: ce sont les récepteurs présents sur leurs membranes qui s’ouvrent et laissent entrer des ions.

    Monsieur_plastic - Raté :] Tu te souviens de certains trucs, mais ce n’est pas tout à fait çà.
    Le calcium est le principal messager intracellulaire, il est utilisé pour quasiment toutes les signalisations connues. Mais c’est aussi un des ions les plus toxiques qui soit pour la cellule. Son utilisation est donc très compartimentée et contrôlée. Pour l’activité des neurones, il s’agit en effet de provoquer une dépolarisation de la membrane, en faisant entrer des ions positifs dans la cellule, mais en général c’est du sodium (Na+). Ensuite, cette dépolarisation peut faire entrer du calcium car il existe des canaux calciques qui s’ouvrent lors d’une dépolarisation. Ce que j’observe est donc indirect: ce n’est pas le message en lui même, mais une trace. Et un neurone qui concentre du calcium, ça veut dire qu’il ne maitrise plus cette compartimentation et qu’il meurt.

    Et ‘pourquoi’ il meurt… Hé bien je l’ai un peu sorti de son rat, empalé avec une pipette, rempli de substances toxiques, irradié au laser, et c’était un sensible :]
    On réussit environ un enregistrement sur 5, avoir 1 ou 2 presque bonnes cellules dans la journée, c’est bien.

  16. Monsieur_plastic dit :

    Je sais que c’est chiant comme questions mais en meme tu hatise énormément la curiosité: si le calcium est utilisé dans presque toutes les signalisations connues comment il peut ne pas y avoir mélange de ses differentes voies? Je m’explique: si le calcium entraine ceci dans la voie A, pourquoi il ne va pas non plus entrainer ceci dans la voie B? Est-ce que c’est tout simplement parce que dans la voie A il y a des molécules qui peuvent interagir avec le Ca et que c’est molécules ne sont pas présente dans la voie B?

    "Ensuite, cette dépolarisation peut faire entrer du calcium car il existe des canaux calciques qui s’ouvrent lors d’une dépolarisation" C’est quoi l’interet principale des ces cannaux?? Propager le pa le long de l’axone? J’ai bien cherché sur wikipedia mais j’ai pas pas bien compris, il y a d’abord dépolarisation, puis au bout d’un certain seuil il y un potentiel d’action. Mais quest-ce qui définit ce seuil exactement, d’un point de vue physiologique j’entend?
    Si j’ai bien compris:
    -dépolarise neurone via entré d’ions positifs
    -a partir d’un certain seuil, l’axone va propager un potentiel d’action sur les autres neurones sur lequel il est "connecté", mais la je bloque, c’est quoi la difference entre un pa et une dépolarisation?-> Le pa à une valeur définit qui est toujours la meme, il est suivie d’une periode refractaire, il a un graphique (j’entend shéma du potentiel de mb en fonction du temps) caractéristique,c’est bien ca?

    Et puis enfin je ne comprend pas l’interet de t’es experiences. Parce que ok la dendrite elle se dépolarise sous l’effet des dépolarisations synaptiques mais ca fait un peu 30 ans que vous savez ca nan?

    Voila voila et merci encore d’assurer le service après vente, pour une fois qu’il y un blog interessant…

  17. Syla dit :

    Monsieur_plastic - Pour le mélange des voies, c’est une des grandes études du moment. D’une part, le signal calcique peut être très localisé. Pour les synapses, on parle de ‘microdomaine’ calcique: un récepteur NMDA s’ouvre, il laisse entrer du calcium, mais celui-ci est re-capturé si vite qu’il ne peut activer de protéines que dans un rayon de quelques nanomètres. Tout va donc dépendre des protéines présentes à proximité, qui seront activées ou non et transmettront le signal de leur côté.

    Du coup, deux choses importantes:

    * Ce n’est pas vraiment le signal calcique qui compte, mais sa conjugaison avec les autres signaux protéiques. Et ce n’est pas un seul signal qui se propage selon une seule voie, mais une combinatoire de signaux empruntant plusieurs voies (qui s’entrecroisent, s’inhibent, etc…)
    * C’est la merde. On ne possède aucun moyen de marquer une protéine potentiellement intéressante avec la résolution nécessaire et in-vivo, sachant qu’un déplacement de 1-2 micromètres est capital. La question n’est plus ‘telle protéine est elle présente ? Si oui, c’est cette voie !’ mais ‘On sait que toutes sont présentes ou presque, mais elles sont activées comment et agencées comment ?’ Du coup la complexité est augmentée de manière exponentielle et on n’a pas d’outils pour traiter ça en masse. Tout ce qu’on peut faire, c’est vérifier si une protéine est présente, essayer de l’inhiber ou la suractiver, et voir au final ce que ça donne en supposant que toutes les autres voies d’activation n’ont pas trop bougées (ce qui est faux, tout se compense). Donc y’a du boulot, chaque mois il y a des modifications et des découvertes selon lesquelles c’est encore plus compliqué.

    Voilà une infirme partie, en postsynaptique:

    Pour la transmission synaptique, les canaux s’ouvrent par l’action d’un neurotransmetteur et laissent entrer du sodium. Cela provoque alors une dépolarisation du neurone (qui est au repos autour de -70mV: l’intérieur est plus négatif que l’extérieur, donc si des ions positifs entrent ou des négatifs sortent, cela fait une dépolarisation). Cette dépolarisation se propage de manière passive le long de la membrane du neurone (PPSE: Potentiel Post-Synaptique Excitateur, ou EPSP). Mais si cette dépolarisation est suffisante (autour de -40 mV), il y a ouverture des canaux sodiques voltage-dépendants. Ils ne dépendent que du voltage autour. Et ils sont très (très) puissants, laissent entrer tellement de sodium que cela active les canaux V-dépendants d’à côté, et donc le signal se propage tout seul jusqu’au bout du neurone. C’est le potentiel d’action, celui que l’on voit en terminale, avec le graphique caractéristique que tu cites.

    Et pour l’intérêt des expériences, en effet je ne montre que les manips ‘poubelles’, en fait je ne travaille pas là-dessus exactement. Tu as raison, ça fait longtemps qu’on le sait. Ce que je regardais, c’était l’effet de certains traitements sur les astrocytes, qui pouraient modifier l’activité des neurones. Et là, sur cette vidéo, je ne peux rien dire car le neurone meurt, ce qui est un peu non-physiologique.

  18. Azelm dit :

    Comme Monsieur_Plastic l’a déjà dit, c’est un blog intéressant que je ne manquerai pas de suivre régulièrement à l’avenir !
    Merci en tout cas de te faire chier à "partager" avec nous (même si ce n’est probablement que des miettes pour toi !).

  19. elpopo dit :

    je préfère ton blog quand tu mets des photos ^^

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